OBTENCIÓN DE INÓCULO Adenovirus aviar SEROTIPO 8b EN CÉLULAS LMH

OBJETIVO.

El objetivo del estudio es producir un inóculo viral inactivado de Adenovirus aviar serotipo 8b (FAdV-8b) usando células LMH como plataforma de cultivo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Línea Celular y virus.

Célula de hepatoma de pollo (LMH) cultivada a 37°C y 5% de CO₂ en medio DMEM, con 10% de Suero Bovino Fetal (SBF). Virus FAdV-8b fue aislado desde una granja de pollos de engorde.

Producción de FAdV-8b.

LMH al 70 % de confluencia fueron infectados con FAdV-8b a un MOI de 10 y se incubó a 37°C y 5% de CO₂; 96 h después, se cosechó y centrifugó a 4000 RPM por 30 min a 4°C. Luego, el sobrenadante fue filtrado en 0,22 µm.

Titulación   de   FAdV-8b   mediante TCID50.

En placa de 96 pozos fue sembrado con 3,0 x 104 células, en 100 µL de medio DMEM con 10% de SBF y se incubó a 37°C y 5% de CO₂ por 8 h. Luego, se prepararon diluciones seriadas del virus desde 10-1 hasta 10-10, y 100 µL de cada dilución fue adicionada en los pozos, 8 réplicas por cada dilución. La placa fue incubada a 37°C en 5% de CO₂ por 7 días. Se contó el número de pozos infectados y se realizó el cálculo del título viral por TCID₅₀

La Figura 2 muestra la evolución del título viral en el cultivo de LMH, alcanzando un título viral máximo a las 96 hpi: 4,7 x 108 TCID50/mL. Se observó que las muestras virales tratadas con BEI no causaron alteración de la morfología o monocapa de las células LMH (Figura 3A), y presentaron similares características a cultivos control negativo de infección (Figura 3C). Las muestras virales sin tratamiento BEI (Figura 3B) causaron alteración de la morfología y pérdida total de la monocapa, de manera similar al control positivo (Figura 3D). Por tanto, la muestra tratada con BEI perdieron su capacidad de infectar y se considera inóculo viral inactivo.

CONCLUSIONES

Se alcanzó un título de FAdV-8b de 4,7  x 108 TCID50/mL, que fue inactivada con BEI exitosamente, lo cual le confiere a este producto un gran potencial para uso en vacuna. Se ha establecido un método estandarizado para la obtención de un inóculo viral inactivado para una potencial vacuna FAdV-8b que alcanzó un título viral mayor a 108 TCID /mL

Figura 1. Cambios morfológicos de células LMH en ausencia (A) o presencia de FAdV- 8b.

Inactivación con BEI.

Se preparó etilenimina binaria (BEI) de una mezcla de 0,58M de bromhidrato de 2-bromoetilamina y NaOH de 0,5M, incubada a 37°C por 1 h. BEI se añadió a la suspensión viral (concentración final 29 mM) y se incubó a 100 rpm, a 37°C por 18h. Luego, se adicionó una solución de tiosulfato de sodio 1,26 M, 10% del volumen del BEI usado, para neutralizar el BEI residual

Pérdida de Infectividad.

Muestras virales (tratadas y no tratadas con BEI) fueron inoculadas en cultivos LMH al 70% de confluencia. Se retiró el sobrenadante, y 0,5 mL de muestra viral fue adicionada en la monocapa de células y se incubó por 1h a 37°C. Luego, se adicionó medio DMEM con 10 % SBF e incubó a 37°C y 5% de CO₂ por 7 días. Ausencia de efecto citopático se consideró como pérdida de infectividad. Como control negativo se usó un cultivo LMH sin adición de virus.

RESULTADOS

A las 72 hpi (Figura 1B), se observó pérdida casi total de la morfología y monocapa celular, gran cantidad de cuerpos celulares en suspensión y restos celulares.

Figura 2. Evolución de carga viral

Figura 3. Cambios morfológicos microscópicos de células LMH con FAdV-8b tratado con BEI (A), o inoculado con FAdV-8b sin tratamiento BEI (B). Control negativo, cultivo LMH en ausencia de FAdV-8b (C). Control positivo, cultivo LMH en presencia de FAdV-8b (D).